Вестник МГТУ, 2026, Т. 29, № 3.

Для идентификации пептидного состава полученных гидролизатов образцы предварительно обессоливали на микроколонках SDB-RPS StageTip. Обессоленные образцы в объеме 2 мкл загружали на предколонку размером 50*0,1 мм, заполненную сорбентом Reprosil-Pur 200 C18-AQ с размером частиц 5 мкм (Dr. Maisch Matrix, Германия), в подвижной фазе, содержащей 98 % воды, 2 % ацетонитрила и 0,1 % ТФУ при скорости потока 4,2 мкл/мин. Обращенно-фазную хроматографию проводили с использованием системы Ultimate 3000 Nano LC System (Thermo Fisher Scientific, США), соединенной с масс-спектрометром Orbitrap Lumos Tribrid Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific, США). Перед анализом образцов и между ними для верификации воспроизводимости времени выхода пептидов с колонки и чувствительности масс-спектрометра вносили триптический гидролизат цитохрома C в количестве 100 фмоль. Хроматографическое разделение осуществляли с помощью двух растворителей: А (99,9 % воды и 0,1 % муравьиной кислоты) и Б (19,9 % воды, 0,1 % муравьиной кислоты и 80 % ацетонитрила). Таблица 1. Перечень ферментных препаратов, используемых для ферментативного гидролиза изолята белков Table 1. List of enzyme preparations used for enzymatic hydrolysis of protein isolates Коммерческое название ФП Наименование компании pH действия Температура действия, °С Активность по ГОСТ 34430-20 183, ед. ПС/г "Alcalase 2.4 L FG" Novonesis A/S 8,0 45 640 ± 32 "Neutrase 0.8 L" Novonesis A/S 7,0 45 612 ± 30 "Flavourzyme 1000 L" Novonesis A/S 7,0 50 607 ± 30 "Пепсин" HiMedia Laboratories Private Limited 3,0 37 395 ± 20 "Трипсин" HiMedia Laboratories Private Limited 7,5 37 242 ± 18 Полученные данные масс-спектрометрии обрабатывали с помощью программного обеспечения Peaks studio 11.0 (Bioinformatics Solutions Inc., Канада). Для прогнозирования потенциальной биологической активности полученных пептидов использовали БД Peptide Ranker (Mooney et al., 2012), позволяющие оценить вероятность пептидов проявлять биологическую активность, БД BIOPEP-UWM (Minkiewicz et al., 2019) для предсказания антиоксидантной активности и ингибирования AHT и DPP-IV, AHTpin (Kumar et al., 2015) для оценки антигипертензивной активности, ToxinPred (Gupta et al., 2013) для прогнозирования токсичности и AlgPreg2 (Sharma et al., 2021) для аллергенности, AntiCP 2.0 ( Agrawal et al., 2021) для оценки противоопухолевой активности, AntiBP3 (Bajiya et al., 2024) для идентификации потенциальных антибактериальных пептидов, AntiTbPred (Usmani et al., 2018) для поиска пептидов с противотуберкулезной активностью и AntiFP (Agrawal et al., 2018) для противогрибковых пептидов. Все прогнозы носили предварительный характер и требуют дальнейшей экспериментальной проверки. Сравнение экспериментальных и теоретических пептидных последовательностей проводили с использованием программы "ЭкспТеоПеп", выполняющей локальное выравнивание последовательностей по алгоритму Смита - Ватермана. Для каждого экспериментального пептида в отфильтрованной по источнику белка, наименованию белка и ферменту теоретической базе осуществлялся поиск наилучшего совпадения с учетом допустимого числа замен и гэпов. Рассчитывались процент идентичности, покрытие, число замен и гэпов, балл выравнивания. По пулу пептидов определялась общая сходимость (доля экспериментальных пептидов, имеющих соответствие) и средние метрики. Результаты и обсуждение Ферментные препараты "Alcalase 2.4 L FG", "Neutrase 0.8 L" и "Flavourzyme 1000 L" выбраны ввиду их высокой гидролитической активности, перспективности получения с их помощью новых биологически активных пептидов, широкой представленностью в аналогичных научных работах и высоким спросом на рынке ферментных препаратов. Использование трипсина и пепсина обусловлено их ключевой ролью в пищеварении. Это дает возможность косвенно оценить эффективность гидролиза изучаемых белковых изолятов in vivo, охарактеризовать пептидный профиль, предсказать потенциальную биоактивность и сопоставить результаты с данными для других коммерческих ФП. Получение гидролизатов с выбранными ферментами осуществляли согласно условиям, представленным в табл. 2. 3 ГОСТ 34430-2018. Ферментные препараты для пищевой промышленности. Метод определения протеолитической активности. М., 2018.